论文网-结肠癌患者外周血DcR3与CEA联合测定的临床价值论文-酷论文网

结肠癌为我国发病率较高的恶性肿瘤之一，手术为最有效的治疗手段。然而术后生存率并不理想。根治性手术后的患者中仍有20%-45%可出现远处转移。早期定量检测出外周血中的循环肿瘤细胞并及早有效的综合治疗，具有重要的临床意义[1]。有的研究者认为结肠癌的发生是一个涉及多种癌基因及抑癌基因多个阶段的过程，是多种癌基因协同作用的结果[2]。DcR3(decoy receptor 3)是新近发现的肿瘤坏死因子受体家族的成员,表达一种缺乏跨膜序列的可溶性分泌蛋白，可竞争Fas与FasL的结合，从而阻断由Fas介导的细胞凋亡，在多种肿瘤及自身免疫性疾病中高表达，被认为和肿瘤的发生、发展以及免疫逃逸密切相关[3]。而癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)是目前应用最广泛的肿瘤标志物之一，在结肠癌及其他恶性肿瘤有不同程度的阳性率，尤在结、直肠癌患者中升高最显著[4]。但是，CEA不是恶性肿瘤的特异性标志，在诊断上只有辅助价值[56]。目前，CEA检测在临床上已经成为常规检查，主要用于结肠癌患者的预后判断、疗效观察以及复发和转移的监测。为了明确DcR3基因在结肠癌患者体内过度表达的意义，我们采用RT PCR检测了结肠癌患者外周血中该基因的mRNA表达水平，探讨其与结肠癌的相关性，以建立取材于外周血早期诊断结肠癌的新方法。字串6

　　1 材料与方法字串5

　　1.1 标本来源字串5

　　2004年5月至2005年12月在西安交通大学医学院第一附属医院就诊，经病理学确诊的初发结肠癌患者44例，男25例，女19例，年龄27-78岁，平均52岁。健康对照组30例，男18例，女12例，年龄28-65岁，平均46岁。字串8

　　1.2 主要设备和仪器

字串6

　　7700型荧光定量PCR仪系美国PE公司产品；TGL16M型高速冷冻离心机系长沙科威实业有限公司产品；LD52A型低速离心机系北京医用离心机厂产品；DRHW2电热恒温水温箱系北京西城区医疗器械厂产品；SANYO型低温冰箱系日本日立公司产品；凝胶电泳成像分析系统TannonGIS1000系上海Tannon有限公司产品。

字串6

　　1.3 主要试剂字串7

　　细胞总RNA TRIzol提取液系美国Promega公司产品；cDNA第一链合成试剂盒系美国Fermentas公司产品；DNTPs系美国Promega公司产品；Taq DNA聚合酶系晶美生物制品公司产品；引物系上海生工生物工程公司合成。其他生化试剂均为国产或进口分析纯。字串9

　　1.4 检测方法

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　　1.4.1 外周血单核细胞分离字串9

　　每个实验对象抽取5mL静脉血，肝素抗凝，用常规密度梯度离心法分离外周血单核细胞，用预冷的生理盐水洗3遍后，迅速放入-70℃冰箱冻存备用。

字串6

　　1.4.2 RNA的提取及RT PCR

字串1

　　用细胞总RNA TRIzol提取液提取总RNA。1μg总RNA进入逆转录体系转录合成cDNA，然后用DcR3、CEA、β actin基因的特异性引物进行扩增。DcR3基因引物顺义链为 5′TCAATGTGCCAGGCTTTC3′，反义链为5′GCCTCTTGATGGAGATGTCC3′；CEA基因引物顺义链为5′TAGCTACTTACTTACTACTCCT 3′，反义链为5′CTTTTGTCCCGGCACATCGGGC3′； β actin基因引物顺义链为 5′TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA3′，反义链为5′CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG3′。取1μL逆转录产物进入PCR体系，在PCR仪内94℃预变性5min，94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 2min共37个循环，最后72℃延长5min，分别扩增DcR3、CEA和β actin基因片段。字串5

　　1.4.3 PCR产物的相对定量分析

字串1

　　6μL PCR产物经15g/L(1.5%)的普通琼脂糖凝胶电泳后，溴化乙啶染色，通过TannonGIS影像分析仪进行DNA条带和强度分析，把DcR3和CEA与β actin的比值作为DcR3和CEA基因的相对表达水平进行比较。

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　　1.5 统计学处理

字串2

　　DcR3和CEA基因的相对表达水平数据以±s表示，结肠癌患者与健康人比较采用t检验。