论文网-基质金属蛋白酶9在宫颈癌中的表达及意义论文-酷论文网

　　在肿瘤侵袭、转移过程中，细胞外基质(extracelluiar matrix, ECM)的降解是肿瘤侵蚀正常组织和开始转移的重要途径。ECM的降解依靠蛋白水解酶，这些蛋白水解酶主要可分为4类，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是其中较为重要的一类。MMP9是MMPs家族中的重要一员，又称Ⅳ型胶原酶或明胶酶B，在MMPs家族中分子量最大，无活性的前体分子的分子量为92ku，具有酶学活性的蛋白质分子量为82ku，人类MMP9位于染色体20q12-q13，基因全长4506bp。大量研究表明，MMP9在多种恶性肿瘤中呈过度表达，降解破坏ECM中最主要组份Ⅳ型、Ⅴ型胶原和明胶，与肿瘤的浸润转移密切相关[1]。本研究通过免疫组织化学SP法检测MMP9在正常宫颈组织、宫颈原位癌、宫颈浸润癌中的表达，以探讨MMP9在宫颈癌浸润和转移中的作用及其临床价值。字串8

　　1 材料与方法 字串2

　　1.1 临床资料 18例正常宫颈组织、20例宫颈原位癌及55例宫颈浸润鳞癌标本均来源于陕西省肿瘤医院2001年1月-2005年11月手术标本或宫颈活检标本，均未行放疗或化疗，临床及病理资料完整，年龄32-64岁，平均年龄49.2岁。按国际妇产科联盟(FIGO)的标准，55例宫颈浸润癌Ⅰ期22例(40.0%)，Ⅱ期33例(60.0%)。病理分级Ⅰ级8例(14.5%)，Ⅱ级33例(60.0%)，Ⅲ级14例(25.5%)。肿瘤直径≥4cm者32例(58.2%)，肿瘤直径<4cm者23例(41.8%)。浸润宫颈壁<2/3者18例(32.7%)，浸润宫颈壁≥2/3者37例(67.3%)。盆腔淋巴转移者19例(34.5%)，盆腔淋巴未转移者36例(65.5%)。

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　　1.2 主要试剂兔抗人MMP9多克隆抗体(浓缩型，用时稀释为1∶100)、免疫组织化学染色试剂盒、浓缩型DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。字串2

　　1.3 实验方法标本经100mL/L福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片，厚5μm，并行常规HE染色经病理科专家阅片复诊。免疫组织化学SP法按试剂盒说明书进行。组织切片脱蜡至水，PBS缓冲液振洗3min×3；置于耐高温切片架上，放入已沸腾的高压锅中进行组织抗原热修复，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，从喷气开始计时，2min后压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，蒸馏水冲洗两次，PBS液振洗3min×3；30mL/L H2O2去离子水消除内源性过氧化物酶活性，室温下孵育10min，PBS缓冲液振洗3min×3；正常山羊血清封闭，室温孵育15min；加适当比例稀释的第一抗体，37℃孵育2h，PBS缓冲液振洗3min×3；加生物素标记的第二抗体，37℃孵育15min，PBS缓冲液振洗3min×3；加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育15min，PBS缓冲液振洗3min×3；DAB显色，苏木素浅染，脱水，封片，镜检。阴性对照为用PBS取代一抗，阳性对照为已知阳性片。字串6

　　1.4 结果判定标准采用半定量积分法，MMP9染色阳性为细胞浆淡黄至棕黄色。每张切片随机选取5个不同的视野(×400)，分别计数阳性细胞数并计算其算术平均值。分级标准：阳性细胞数<5%，0分；6%-25%，1分；26%-50%，2分；>50%，3分。着色程度：无，0分；淡黄，1分；棕黄，2分；棕褐，3分。将每张切片阳性细胞数与着色程度的得分相乘为最后得分。0-1 分为阴性(-)，2-3分为弱阳性(+)，4-5分为中度阳性()，6分以上为强阳性()。由高年资病理科医师在多头显微镜下共同阅片并打分。最后得分≥2者均判定为阳性表达。字串7

　　1.5 统计学处理对所得数据以DAS ver1.0 (Drug And Statistics for Windows)统计软件包进行卡方检验、两组等级资料秩和检验，以α=0.05为检验水准。

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　　2 结果

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　　2.1 MMP9在宫颈组织中的表达 MMP9蛋白主要定位于细胞浆。MMP9在宫颈浸润癌组织中多为中到强阳性表达，在肿瘤周围间质中的成纤维细胞有弱到中度阳性表达，还可见于中性粒细胞、巨噬细胞、浆细胞、多核巨细胞。在浸润癌中MMP9的表达强于原位癌及正常对照(图1)。统计学分析显示MMP9在宫颈浸润癌中表达率明显高于正常宫颈组织(P=0.00)和宫颈原位癌(P<0.05)，有显著性差异；宫颈原位癌与正常宫颈组织的阳性表达率无显著性差异(P>0.05，表1)。